Глоссарий:
B-клетки — это клетки адаптивного иммунитета. У них есть рецепторы, которые называются иммуноглобулины. Определенные подвиды B-клеток (плазматические клетки) могут секретировать эти рецепторы в кровь, тогда мы их называем антителами. T-клетки — это тоже клетки адаптивного иммунитета. Одни их виды (хелперы) могут активизировать общий иммунный ответ, другие (киллеры) — убить зараженную вирусом или мутировавшую клетку. Почти все клетки, обладающие ядром, «показывают» Т-клеткам кусочки белков, которые производят, на специальных комплексах гистосовместимости. Если клетка производит неправильные белки, то Т-клетка может ее убить. Антитела — это секретируемые (выделяемые) рецепторы B-клеток. Они формируются случайной рекомбинацией генов и мутагенезом, чтобы организм мог распознать самые разные молекулы на поверхности патогенов. Антигены — это молекулы, которые иммунная система способна распознать. У рецепторов B- и Т-клеток есть возможность связываться с антигенами. Антигенами могут быть как молекулы на поверхности патогенов (например, бактерий), так и молекулы, которые производятся клетками организма-хозяина.
В 2012 году семилетней Эмили Уайтхэд не на что было надеяться — ей диагностировали острый лимфобластный лейкоз — очень агрессивную форму рака: опухоль развивается за дни и недели (а не годы, как это бывает с солидными — твердыми, от английского solid — опухолями легких, кишечника, печени). Имя девочки осталось в истории, благодаря спасению ее жизни с помощью технологии адресной доставки лекарств.
Чем адресная доставка лекарств отличается от обычной
Когда больной выпивает антибиотик, тот путешествует по всему телу, а проблема, скажем, в легких. Активное вещество всасывается в кровь и часть его добирается до очага инфекции. Это похоже на поиск потерявшихся в лесу — участвуют 500 человек, но найдут двое. Остальные вытопчут цветы, распугают животных — то есть от обилия лекарств в организме будут страдать печень, почки и т.д. Антибиотики часто действуют на те же элементы бактерий, которые есть и у человека, и хотя наши рибосомы, которые синтезируют белок, или топоизомеразы (которые участвуют в синтезе новой ДНК или РНК) отличаются от бактериальных, но многие антибиотики токсичны для людей тоже, и поэтому используются с осторожностью.
Но с антираковыми препаратами дело обстоит еще хуже: опухолевые клетки — это переродившиеся клетки самого пациента. Очевидно, что их отличия от здоровых клеток еще более тонкие, чем отличия клеток бактерий и человека. Традиционная антираковая химиотерапия применяет стратегию выжженной земли — вводимый внутривенно препарат действует на все быстро делящиеся клетки в организме, и от этого у проходящих «химию» людей выпадают волосы, снижается иммунитет, страдает ЖКТ, ухудшается общее самочувствие.
Так почему бы не создать лекарство, которое могло бы бить целенаправленно?
Нанометровая пилюля против рака
Описать адресную доставку лекарств можно через принцип наноконтейнеров. Концепция такова: лекарство заключают в микроскопический контейнер с «ключом» на поверхности — молекулой, взаимодействующей именно с раковой клеткой. Это может быть антитело, которое может присоединиться только к определенному месту молекулы, или специфический лиганд, то есть молекула, вступающая в связь с белком, например, рецептором. Бывает, что из-за генетических нарушений раковые клетки пользуются генами, которые должны «молчать», в этом органе или на этой стадии развития организма. Так что адресная доставка требует детальной молекулярной диагностики — врачи должны знать, чем клетки конкретной опухоли отличаются от нормальных.
Наноконтейнер — это чужеродный элемент для организма, а умение бороться с проникновениями чужаков у организма заложено на генетическом уровне. Поэтому у ученых возникла идея маскировать нанокапсулы с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ). Но оказалось, что при повторном введении организм может «выбрасывать» лекарство за считанные часы. Так работает гонка вооружений — либо рак учится уходить от терапии, либо сам организм показывает что-то новенькое, что раньше было не известно.
Прорывной проект конструирования различных наноструктур (нанокапсул, мицелл, полиэлектролитных наночастиц и других систем) как носителей для доставки лекарств, в том числе больших молекул ферментов и нуклеиновых кислот был начат еще в 1980-х с участием ученых кафедры химической энзимологии Химфака МГУ.
Наталья Клячко, заведующая кафедрой химической энзимологии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова:
«В клинике используется ряд лекарственных препаратов на основе нанокапсул. Весьма старым, принятым еще в 1995 году, является Doxil — хорошо известный химиотерапевтических препарат доксорубицин, заключенный в липосомы — мягкие капсулы из тех же жиров, из которых состоят мембраны клеток человека. Такая упаковка позволила уменьшить его кардиотоксичность (пагубное воздействие на сердце). Более новый препарат Abraxane вышел на рынок в 2005 году и успешно применяется для лечения онкологических пациентов, — его состав стабилизирован с помощью наночастиц, состоящих из белка сыворотки крови человека — альбумина.
Начинают применяться моноклональные антитела (МАТ) — искусственно созданные в лаборатории белки, которые работают как точные копии естественных защитных антител организма. Они нацелены на поиск и блокировку только одной конкретной опасной молекулы или клетки. Среди них, например, ритуксимаб («Мабтера», «Ацеллбия»), бевацизумаб («Авастин»), трастузумаб («Герцептин»), а также МАТ, химически соединенные с лекарством, такие как брентуксимаб ведотин («Адцетрис»). Но проблем немало: цена, сложности описания эффектов в ряде случаев, трудности масштабирования производства, ограниченные возможности в использовании и многое другие. В этом направлении много задач для будущих исследователей и инженеров».
Заводские антитела
Лекарство, конъюгированное (соединенное) с антителом — другой вариант адресной доставки. Принцип тот же, но без контейнера.
Сейчас производство антител к специфическим антигенам, то есть тем молекулам, которые либо мутировали в раковой клетке, либо вообще не должны там находиться — одна из отраслей биотехнологии. Можно сделать даже не целое антитело, а лишь ту часть, которая распознает антиген. Классическая молекула иммуноглобулина (так называются антитела в науке) похожа на букву Y. Парные концы «сверху» распознают антиген, а «ножка» подает сигнал уничтожения и выведения из организма. Если поймать клетку, которая производит определенные антитела, то можно узнать генетический код этого антитела. Поскольку известно, какие участки генома кодируют иммуноглобулины, мы можем выделить фрагмент, отвечающий за связывание антигена. Для соединения с лекарством достаточно взять небольшой кусочек — «верхний хвостик» от Y.
Например, существует HER2-положительный рак молочной железы. HER2 — рецептор эпидермального -? фактора роста. В норме его немного, но на поверхности HER2+ раковых клеток он представлен избыточно, что делает эту форму рака с одной стороны довольно агрессивной, но с другой — хорошей мишенью для ADC-терапии (antibody-drug conjugates — антитела, конъюгированные с лекарством). Один из таких препаратов — трастузумаб дерукстекан. Это антитело, соединенное с ингибитором ДНК-топоизомеразы. При блокировке топоизомеразы клетка не может ни синтезировать РНК, что нужно для ее жизнедеятельности, ни ДНК, что нужно для деления.
А если попроще?
Как работает препарат (трастузумаб дерукстекан): это «умная бомба» на состоит из двух частей:
Наводчик (антитело): это «ключ», который подходит только к «замку» HER2. Он находит раковую клетку и прикрепляется к ней. Заряд (ингибитор — «яд»): это вещество, которое блокирует в клетке главный «производственный станок» (топоизомеразу).
Зачем нужен этот станок? Представьте, что клетке для жизни нужны две вещи:
«Инструкция» (РНК) — чтобы работать прямо сейчас. «Чертежи» (ДНК) — чтобы делиться и создавать копии.
«Станок» (топоизомераза) нужен, чтобы распутывать клубки этих нитей (РНК и ДНК) и читать их.
В итоге, когда «бомба» попадает в цель, «яд» ломает этот «станок». Клетка не может прочитать ни «инструкцию» (РНК), ни «чертежи» (ДНК). В итоге клетка погибает.
Поскольку клетки, происходящие из первичной опухоли, продолжают экспрессировать HER2, то трастузумаб дерукстекан подходит и для лечения метастатических опухолей.
Перепрограммирование клеток пациента
Вернемся к Эмили Уайтхэд. Для лечения гематологических опухолей часто применяют пересадку костного мозга. Убивают все кроветворение пациента и подсаживают гемопоэтические стволовые клетки подходящего донора (лучше всего — сиблинга (родного брата или сестры). Для Эмили эта процедура по медицинским показаниям оказалась невозможной. Оставалось или паллиативное лечение, или экспериментальный метод CAR-T терапии, который в 2012 году только выходил в клинические испытания.
У человека два типа клеток адаптивного иммунитета, которые производят рецепторы к чужеродным (патогенным) антигенам. Мы уже говорили про антитела — разновидность рецепторов B-клеток (лейкоцитов), которые выделяются в кровь, «облепляют» патогены и «говорят» другим иммунным клеткам, что именно надо уничтожить. T-клетки не секретируют свои рецепторы, но могут самостоятельно убить патоген, в том числе и неправильную клетку самого организма. Иммунитет убивает почти все неправильные клетки — их за время жизни человека возникает очень много. Только одна самая удачливая избегает этой участи и дает начало опухоли — вероятность растет с возрастом и при контакте с канцерогенами.
К 2012 году ученые уже давно работали над задачей «перезапуска» атаки иммунитета на раковые клетки. Идея в общем-то лежит на поверхности — надо просто подкрутить что-то, что дало слабину и позволило опухоли развиться. Вариантов что «подкрутить» очень много, но что же такое CAR-T?
CAR-T — это химерный (то есть состоящий из нескольких генов) рецептор антигена Т-клеток. Во время CAR-T-терапии (Chimeric Antigen Receptor T-cell therapy) производят забор T-клеток пациента, в их геном встраивается искусственный ген химерного рецептора антигена — он создан на основе естественных генов человека. Этот рецептор специфичен к антигену на поверхности опухолевых клеток — чтобы знать, на что нацеливать CAR-T клетки, нужно провести молекулярную диагностику. После генетических манипуляций клетки пациента выращиваются в лаборатории в количестве миллиардов копий и вводятся обратно пациенту.
А если попроще?
Представьте, что ваша иммунная система — это полиция, а раковые клетки — это преступники, которые научились ходить в гражданской одежде и прятаться от полицейских.
Вот что происходит при CAR-T-терапии по шагам:
Обычные полицейские (Т-клетки) не видят рак, потому что он маскируется. Нужно нанять «стажеров» и обучить их по-новому: у пациента берут немного его собственной крови и вылавливают оттуда Т-клетки (это будущие бойцы). Генная модификация (перепрошивка): в лаборатории этим клеткам вшивают новую «программу-навигатор» (это и есть химерный рецептор). «Химерный», потому что этот навигатор искусственный, склеенный из нескольких кусочков разных генов — такого в природе не бывает. Его создали специально для одной цели. Настройка на цель: в навигаторе прописывают приметы преступника (опухолевый антиген). Чтобы узнать эти приметы, врачи сначала делают биопсию (смотрят, по какому «фотороботу» искать рак). Размножение «спецназа»: для борьбы с раком одной заряженной клетки мало. В лаборатории эту перепрограммированную клетку заставляют делиться до тех пор, пока не вырастет армия из миллиардов копий точно таких же обученных киллеров. Возвращение: Эту огромную армию вводят обратно в кровь пациенту.
Вместо того чтобы давать химию, которая убивает все подряд, при CAR-T-терапии врачи берут собственные клетки иммунитета пациента, чинят? их в пробирке, дают им точные координаты раковой клетки, выращивают из них огромный отряд и возвращают обратно. Теперь у пациента внутри работает свой личный «биологический спецназ», который распознает рак и уничтожает только клетки опухоли, не трогая здоровые ткани.
Чаще всего этот метод терапии используется для гематологических, «жидких» опухолей — солидные опухоли в меньшей степени доступны для CAR-T клеток и у них сложнее подобрать безопасную мишень: если модифицированные клетки будут способны связываться с мишенью на здоровых клетках — это может быть очень опасно для пациента.
Как заставить гены «замолчать»
Адресная доставка осуществляется не только для онкологических пациентов. Помимо злокачественных опухолей есть немало других заболеваний, вызванных не «сломанными» генами, но и просто работающими не в том месте и не в то время.
Наталья Клячко:
«Доставка лекарства в целевые клетки — важная задача, так же как и пролонгированное действие активного вещества. Разработка систем доставки лекарств для терапии нейродегенеративных заболеваний, патологий сердечно-сосудистой системы, а также генотерапия, в частности, редких (орфанных) заболеваний — направления, которые будут с большой эффективностью развиваться в будущем по мере появления новых знаний».
В современной России разработка и адаптация препаратов для орфанных заболеваний выглядит очень привлекательно для бизнеса — регуляторные механизмы мягче, чем для онкологических препаратов, оказывается широкая господдержка, и обеспечен спрос, поскольку практически нет конкуренции.
Неправильный ген можно заставить «замолчать» с помощью РНК-интерференции. Генетическая информация превращается в функциональную молекулу белка через посредника — матричную РНК (мРНК). Попросту — это копия гена, закодированного в ДНК, с которой будет считана информация. В отличие от геномной ДНК, мРНК — одноцепочечная молекула, однако у нее есть потенциал сформировать двойную цепь. Если ввести в клетку другую молекулу РНК, которая будет как детали в пазле совпадать с матричной, то вместе с набором некоторых белков они будут формировать комплекс, который будет мешать считывать генетическую информацию и синтезировать тот самый неправильный или не нужный здесь и сейчас белок. Это и есть РНК-интерференция.
А если попроще?
Представьте, что ДНК — это главный чертеж, в котором есть все. Он хранится в сейфе (ядре клетки) и оттуда не вынимается. Чтобы изготовить деталь (белок), нужна инструкция и копия чертежа этой детали, которую снимают с главного чертежа, эта копия и есть матричная РНК (мРНК). Именно по ней рабочие (клеточные механизмы) изготавливают детали. Но при этом в главном чертеже (ДНК) есть ошибка (мутация), и рабочие по копии упорно готовят бракованные детали (неправильные белки), которые вредят организму.
Вот что делает РНК-интерференция:
В клетку вводят специального агента (другую РНК). Этот агент умеет распознавать именно чертежи этих неправильных деталей. То есть его РНК сделана так, чтобы идеально совпадать с настоящей ксерокопией (как две половинки замка-молнии или детали пазла). Когда агент находит копию этого небольшого чертежа, он поверх какого-то фрагмента приклеивает другой чертеж — две молекулы РНК соединяются друг с другом и образуют двойную нить. Клетка «видит» двойные нити РНК и думает: «Ой! Это, наверное, вирус, которого тут быть не должно!». Она зовет специальных «ревизоров» (белковый комплекс), которые хватают эту соединенную пару и разрушают ее. Настоящая ксерокопия (мРНК) уничтожена вместе с фальшивкой. Рабочие не видят инструкции — и перестают делать бракованные детали. Ген как бы «замолкает» (его информация просто не доходит до производства).
Технология могла бы остаться исключительно лабораторным инструментом, поскольку введенная в кровь молекула РНК разрушается очень быстро — перебросить мостик к клиническому применению помогли липосомы.
Наследственные генетические болезни могут проявляться и во взрослом возрасте. Поэтому такие патологии не «вымываются» из популяции как заболевания, которые не оставляют шанса на потомство. Один из таких недугов — наследственный транстиретиновый амилоидоз. Болезни группы амилоидозов возникают в результате накопления патологического белка (или его фрагмента), который со временем формирует фибриллы или бляшки, не выводится из организма и мешает нормальной жизнедеятельности. Наиболее известный амилоидоз — болезнь Альцгеймера. Но в отличие от нее, для транстиретинового амилоидоза, о котором мы поговорим, есть лекарство.
Транстиретиновый амилоидоз вызывается мутацией в гене TTR (на данный момент известно около 140 вариантов мутаций). Из-за мутации в тканях накапливаются белковые отложения и, в конечном итоге, приводят к полинейропатии (онемение, покалывание, слабость в ногах, боли), нарушению функции ЖКТ, недержанию, сердечной недостаточности, аритмии. Эти симптомы неспецифичны, потому что амилоид накапливается в разных органах и тканях — периферической нервной системе, почках, сердце, органах ЖКТ. Среди методов лечения — препарат Патисиран. Это интерферирующая РНК, которая препятствует накоплению амилоидных отложений в нервной системе, блокируя синтез TTR в печени.
Препарат был одобрен в 2018 году и стал первопроходцем среди лекарств на основе РНК-интерференции — он протоптал дорожку другим, например, Инклисирану, направленному на снижение уровня «плохого» холестерина. Его прописывают людям с высоким риском инфаркта или инсульта, которым по тем или иным причинам противопоказаны или не помогает традиционная терапия. Инклисиран — это небольшая молекула РНК, которая блокирует экспрессию гена PCSK9. Продукт этого гена связывается с рецепторами ЛПНП (липопротеинов низкой плотности, то есть комплексов белков с жирами) на поверхности клеток печени и вызывает их разрушение. Но эти рецепторы и выводят «плохой» холестерин из крови и ведут к его метаболизации в клетках печени. Стало быть, чем меньше рецепторов, тем выше риск атеросклероза — формирования отложений на стенках сосудов, который снижают их проходимость. Следовательно, если блокировать ген PCSK9, рецепторов ЛПНП будет больше, а ЛПНП в крови — меньше.
Добраться до мозга и другие изощрения
Нанокапсулы порой теряют эффективность после первого введения, поскольку в организме начинают вырабатываться к ним антитела. Организм можно и тут перехитрить — использовать вместо искусственных нанокапсул экзосомы. Это те же наноконтейнеры, но секретируемые клетками пациента. В природе они используются для обмена сигналами между клетками. А значит, у них есть все необходимое, чтобы сойти за «своих» — ведь они и есть свои. Сейчас этот метод на самом острие науки. В экзосомы можно загрузить и химиотерапевтический препарат, и молекулу интерферирующей РНК, и антибиотик: есть публикации об успешной доставке лекарств в животных моделях онкологических заболеваний — даже глиобластомы (агрессивной формы опухоли головного мозга, которая очень труднодоступна для лекарств из-за гемато-энцефалического барьера (ГЭБ) — своего рода пропускного пункта, который охраняет мозг от любых посягательств непрошенных молекул и организмов).
Основные трудности в работе с экзосомами при адресной доставке лекарств — очень высокая суммарная потеря экзосом после всех этапов работы: собрать их удается весьма немного, а к моменту обратного ввода в организм их становится еще меньше. Сложно стандартизировать загрузку лекарств и масштабировать производство. Как и другие нанокапсулы, экзосомы могут разрушиться в крови, агрегировать с другими клетками и не довести терапевтическое содержимое до пункта назначения.
Наталья Клячко:
«Мы показали, тем не менее, что экзосомы макрофагов, нагруженные антиоксидантными ферментами (каталазой или супероксиддисмутазой) или генами ферментов, идут туда же, куда и клетки макрофагов — в воспаление, в том числе, в мозг или в спинной мозг, и способны подавить выброс активных форм кислорода, снизить воспаление и существенно предотвратить деградацию нейронов».
Предполагается, что лет через 5-7 технология пройдет клинические испытания и начнется ее широкое применение.
Как и CAR-T, технология экзосомальной доставки лекарств — часть концепции персонализированной медицины. А все, что персонализировано, — дорого. Поэтому для пациентов из России хорошая новость в том, что CAR-T планируют включить в программу ОМС. Туда же могут включить и персонализированные онковакцины — еще один способ заставить иммунную систему бороться с опухолью, на этот раз путем вакцинации уже после заболевания, когда ясно, к чему пациента иммунизировать: этот метод тоже требует индивидуальной молекулярной диагностики.
Физические способы адресной доставки лекарств
Мы все время говорили о биохимических методах адресной доставки, но проводятся эксперименты и по физическому воздействию на очаг заболевания. Горячая тема — преодоление гемато-энцефалического барьера и доставка лекарства в головной мозг. В России эта тема активно изучается, например, в группе Глеба Сухорукова в Сколтехе — через обонятельный эпителий в носу мыши удалось доставить наночастицы непосредственно в мозг животного. Аналогичную систему создали в Сеченовском университете и доказали ее эффективность на крысах.
А вот в Канаде ГЭБ буквально «раздвинули» с помощью ультразвука. Бонни Холл на протяжении восьми лет жила с доброкачественной глиомой, которая вдруг переродилась в злокачественную. В ноябре 2015 года после введения химиотерапии и микроскопических пузырьков воздуха, для преодоления лекарством ГЭБ врачи использовали сфокусированный ультразвук. Вибрация пузырьков воздуха создала зазоры между плотно упакованными клетками, выстилающими сосуды головного мозга, и позволила лекарству выйти из кровотока непосредственно в очаг опухоли. Новообразование удалили хирургически через несколько дней и последующее изучение тканей опухоли показало, что метод сработал. Как жила Бонни Холл после — врачебная тайна. Но известно, что ее случай доказал эффективность и безопасность сфокусированного ультразвука для точечной доставки лекарств к тканям головного мозга, минуя ГЭБ. Сейчас этот метод позволил увеличить ожидаемую продолжительность жизни пациентов с глиобластомой на 40%.
Что такое ДНК-оригами
ДНК-оригами — это, наверное, самый изощренный метод не просто адресной, но и «умной» доставки лекарств. Этот полукомпьютерный метод был придуман Полом Ротмундом. Суть в том, что берется длинная одноцепочечная ДНК — каркас, и к ней подбираются маленькие комплементарные «скрепки», которые формируют локальные двухцепочечные участки и сворачивают всю конструкцию в определенную форму.
Дизайн такой сложной молекулы производится с помощью сложных вычислений, но результат впечатляет — кроме шуточных звездочек и смайликов можно создать контейнер для лекарства, который будет обладать точной загрузкой и высвобождать содержимое (карго) только в определенных условиях.
Ученые создали ДНК-нанобочонок, который высвобождает лекарство только при встрече с клеткой, на которой присутствуют два антигена. Можно запрограммировать форму так, что она будет открываться в определенных химических условиях — при изменении кислотности, встрече с определенным ферментом или при физическом воздействии, например облучении светом.
Препятствия те же — синтез персональных коротких «скрепок» довольно дорог. Может ли контейнер из ДНК быть стабилен в организме — большой вопрос, поскольку нуклеазы — специальные ферменты, призванные резать внеклеточную ДНК, в том числе для борьбы с вирусами — могут привести к разложению контейнера по пути к цели. Как долго ДНК-оригами выводится из организма и где может накапливаться — тоже пока неизвестно.